Question

【題目】基因打靶技術是建立在基因同源重組技術以及胚胎干細胞技術的基礎上而發展起來的一種分子生物學技術。請結合圖示回答下列有關問題：

注：neor 是新霉素抗性基因；tk 基因的表達可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質，導致細胞死亡。

（1）將目的基因和與細胞內靶基因同源的 DNA 片段都重組到__________上，構建打靶載體（基因表達載體）。

（2）打靶載體測序驗證正確后，利用__________酶，將之線性化，以提高重組率。通過__________技術將打靶載體導入胚胎干細胞，這樣打靶載體和與細胞內靶基因同源的區段就有機會發生同源重組。

（3）為了篩選發生同源重組的細胞，可在培養液中加入__________。最后還需要通過__________技術鑒定同源重組的細胞（去除靶基因），將這樣的細胞通過動物細胞培養后，獲得大量打靶成功的細胞。其中， 暫時不用的細胞進行__________保存。

（4）將打靶成功的細胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、__________的母鼠體內，一段時間后對受體母鼠進行妊娠檢查，確保其生下嵌合體小鼠。這種嵌合體小鼠長大后，體內同時存在被“修飾”過的基因和未被“修飾”的基因。如果某些小鼠的__________（填“體細胞”或“生殖細胞”）恰巧被“修飾”過了，則它們的雜交后代中，就可能出現基因完全被“修飾”過的小鼠。

Answer 1

【答案】載體（或質粒） 限制 顯微注射 新霉素和丙氧鳥苷 DNA分子雜交 液氮（或冷凍） 生理狀態相同（或經同期發情處理） 生殖細胞

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）分析題圖可知，將目的基因和與細胞內靶基因同源的DNA片段都重組到載體（或質粒）上，構建打靶載體（基因表達載體）。

（2）打靶載體測序驗證正確后，利用限制酶，將之線性化，以提高重組率。通過顯微注射技術導入胚胎干細胞，這樣打靶載體與細胞內靶基因同源的區段就有幾率發生同源重組。

（3）neor是新霉素抗性基因，tk基因的表達可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質，導致細胞死亡，因此為了篩選發生同源重組的細胞，可在培養液中加入新霉素和丙氧鳥苷。最后還需要通過DNA分子雜交技術鑒定同源重組的細胞（去除靶基因），將這樣的細胞通過動物細胞（或克隆）培養后，獲得大量打靶成功的細胞。其中，暫時不用的細胞進行液氮（或冷凍）保存。

（4）將打靶成功的細胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、生理狀態相同（或經同期發情）的母鼠體內，一段時間后對受體母鼠進行妊娠檢查，確保其生下嵌合小鼠。這種嵌合體小鼠長大后，體內同時存在被“修飾”過的基因和未被“修飾”的基因。如果某些小鼠的生殖細胞恰巧被“修飾”過了，則它們的雜交后代中，就可能出現基因完全被“修飾”過的小鼠。