Question

【題目】正常細胞不能合成干擾素，但含有干擾素基因。我國科學家釆用基因工程技術生產干擾素a-2b已實現量產。具體做法是將產生干擾素的人白細胞的mRNA分離，反轉錄得到干擾素基因。將含有四環素、氨芐青霉素抗性基因的質粒PBR322和干擾素基因進行雙酶切，用連接酶連接。將重組載體DNA分子在一定條件下導入大腸桿菌，在培養基中篩選培養，檢測干擾素的表達量，選出高效表達的工程菌。請回答：

（1）在分化誘導因子作用下，正常細胞可以擺脫抑制、合成干擾素，該過程發生的實質是________________________________

（2）據下圖分析，構建重組載體DNA分子時，可以選用_____兩種限制酶對質粒pBR322和干擾素基因進行雙酶切，目的是既能保證目的基因和質粒正向連接，又能防止_____________________________(答兩點)。

（3）將重組質粒導入大腸桿菌中，然后將細菌涂布到含_____的選擇培養基上培養，就可得到含質粒PBR322或重組質粒的細菌單菌落；再從每一個單菌落中挑取部分細菌轉涂到含有_____的培養基上，不能生長的絕大部分是含有重組質粒的細菌，原因是_____

（4）干擾素在體外保存非常困難，如果將其分子中的一個半胱氨酸變成絲氨酸，在-70°C 條件下可以保存半年。實現這一轉變需要直接對_____進行修飾或改造，這屬于蛋白質工程的范疇。

Answer 1

【答案】基因的選擇性表達 酶B、酶C 質粒與目的基因自身環化；防止同時破壞質粒中的兩個標記基因 氨芐青霉素 四環素 目的基因的插入破壞了四環素抗性基因，重組質粒上只含有氨芐青霉素抗性基因，而質粒上含氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因，在含有四環素的培養基上，導入重組質粒的細菌不能生長，而只導入質粒的細菌能生長 基因

【解析】

1、基因表達載體的組成：目的基因、啟動子、終止子、標記基因等。標記基因可便于目的基因的鑒定和篩選。

2、由于不同限制酶識別的堿基序列不同，所以在切割質粒和目的基因時常用雙酶切，可防止目的基因反向粘連和質粒自行環化。

（1）細胞分化的實質是基因選擇性表達，故在分化誘導因子作用下，正常細胞可以擺脫抑制、合成干擾素，該過程發生的實質是基因的選擇性表達。

（2）標記基因可用于鑒定目的基因是否導入受體細胞，所以重組質粒上至少要保留一個標記基因，由于兩個標記基因上均含有酶A的切點，所以不能用酶A切割，為了防止連接時目的基因和質粒自身環化，故在構建重組載體DNA分子時，可以選用酶B和酶C兩種限制酶對質粒pBR322和干擾素基因進行雙酶切。

（3）由于質粒和重組質粒上都含有氨芐青霉素抗性基因，而未導入質粒的細菌不含有該抗性基因，所以將重組質粒導入大腸桿菌中，然后將細菌涂布到含氨芐青霉素的選擇培養基上培養，就可得到含質粒PBR322或重組質粒的細菌單菌落；由于目的基因的插入破壞了四環素抗性基因，重組質粒上只含有氨芐青霉素抗性基因，而質粒上含有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因，因此再從前面培養基上獲得的每一個單菌落中挑取部分細菌轉涂到含有四環素的培養基上，不能生長的絕大部分是含有重組質粒的細菌。

（4）蛋白質工程是通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造的一項技術。